Probleem op deze pagina?

Project: Optimalisatie van de redoxstatus voor een betere darmgezondheid in intra-uterien groeivertraagde biggen

LBO - LA: Landbouwonderzoek en Landbouwtrajecten
01/10/2011
30/09/2015

De doelstelling van het project was om de oxidatieve- en redox status van het gastro-intestinaal stelsel te onderzoeken in functie van dier- en voedingsfactoren, en door optimalisatie van deze status de darmgezondheid van IUGR biggen tijdens de opfokperiode (<25 kg) te verbeteren.

Het project zorgt voor een duidelijke toegevoegde waarde voor de Vlaamse varkenshouders, dierenartsen, adviseurs en de veevoedersector.

Het streven naar zeugenlijnen met een grotere worpgrootte is onvermijdelijk verbonden met een hoger percentage intra-uterien groeivertraagde biggen (IUGR). Bij geboorte hebben IUGR biggen een laag geboortegewicht, kleinere energiereserves en zijn veelal minder vitaal. Pasgeboren IUGR biggen vertonen opmerkelijke fysiologische verschillen in vergelijking met toomgenoten met een gemiddeld geboortegewicht die resulteren in een permanent effect op de postnatale groei. Verschillende obstakels dienen overwonnen te worden om deze biggen toch te kunnen opfokken: een sterftecijfer in de groep IUGR biggen van niet minder dan 52-85% tot aan de speenperiode, verminderde groeiprestaties, een hogere ziektegevoeligheid, een lager speengewicht, slechtere voederconversie, hogere slachtleeftijd en een verminderde karkaskwaliteit. Deze obstakels ervaren varkenshouders als een wezenlijk probleem binnen hun bedrijfsvoering. Ongeveer 8-23% van de neonatale biggenpopulatie kan men beschouwen als IUGR. Dergelijke aantallen vormen een financieel risico voor de varkenshouder en zorgen ervoor dat het productiepotentieel van de moderne zeug suboptimaal wordt benut. De economische schade kan begroot worden op ongeveer 19.5 miljoen € in Vlaanderen.

Recente studies tonen aan dat IUGR biggen in een status van oxidatieve stress verkeren en een verstoorde cellulaire redoxfunctie bezitten. Oxidatieve stress wordt gedefinieerd als een onevenwicht in de balans tussen pro- en antioxidanten, waarbij de vorming van reactieve species (vb. H2O2, OH°-, peroxiden) onvoldoende gecontroleerd wordt door de antioxidant beschermingsmechanismen (vb. glutathion redoxkoppel) en tot beschadiging van vitale componenten van biologische systemen (vb. eiwitten, vetten en DNA) leidt. Oxidatieve stress in het gastro-intestinaal stelsel (GIT) leidt tot een afgenomen barrière functie en een gewijzigde mitose/apoptose-balans van het darmepitheel. Hierdoor krijgen micro-organismen en antigenen meer kans om de systemische circulatie te bereiken en is de regeneratiecapaciteit om defecten te herstellen deficiënt. De oxidatieve- en redoxstatus van het darmweefsel speelt dus een belangrijke rol in een optimale darmfysiologie. Daarnaast beïnvloedt het opfoksysteem (vroegspenen versus klassiek spenen; speenleeftijd bij klassiek systeem) de darmontwikkeling, en dit zeker bij een laag geboortegewicht. Vermits een optimale darmontwikkeling en –functie in nauwe relatie staat met de zoötechnische prestaties biedt optimalisatie van de oxidatieve- en redoxstatus van het GIT bij IUGR biggen in functie van het opfoksysteem opportuniteiten om de problematiek van deze biggen aan te pakken.

De doelstelling van het project was om de oxidatieve- en redox status van het gastro-intestinaal stelsel te onderzoeken in functie van dier- en voedingsfactoren, en door optimalisatie van deze status de darmgezondheid van IUGR biggen tijdens de opfokperiode (<25 kg) te verbeteren. Deze doelstellingen werd opgedeeld in 8 deeldoelstellingen die benaderd werden via 4 werkpakketten. Hierna volgt een samenvatting van de bereikte resultaten voor elke deeldoelstelling.

Deeldoelstelling 1: Ontwikkelen van een in vitro model om het effect van oxidatieve stress op de epitheliale barrièrefunctie en regeneratiecapaciteit te kunnen onderzoeken. Bepalen van relevante merkers en targets. (WP1)

Een in vitro IPEC-J2 celcultuur model werd geïmplementeerd waarbij de relatie tussen oxidatieve stress en barrière functie en regeneratievermogen werd onderzocht. Waterstofperoxide (radicaal vormer) en diethylmaleaat (conjugatie met glutathion) werden gebruikt om de celcultuur te verstoren. Er kon duidelijk aangetoond worden dat deze oxidatieve stressoren de cellulaire distributie van het tight-junction eiwit zona occludens-1 veranderde, significant het niveau van intracellulaire oxidatieve stress verhoogde (adv. fluorescente probe CM-H2DCFDA), de integriteit van de monolayer reduceerde (gemeten via transepitheliale weerstand, en fluorescein isothiocyanate-dextran, FD-4, permeabiliteit), de cytotoxiciteit en celsterfte verhoogde (neutral red staining) en de regeneratiecapaciteit verminderde (wound healing assay). Pre-incubatie van de celcultuur met 2 mM Trolox (wateroplosbare vorm van alfa-tocoferol) en 1 mM ascorbinezuur kon op significante wijze het effect van de oxidatieve stressoren op intracellulaire oxidatieve stress, wound healing capacity en FD-4 permeabiliteit verminderen. Toevoeging van glutathion monoethyl ester (10 mM) had enkel een gunstig effect in cellen die behandeld werden met diethylmaleaat. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat dit IPEC-J2 celcultuur model een geschikte tool is om antixodanten in vitro te gaan screenen. Vervolgens werd een strategie vooropgesteld om antioxidanten te screenen. In eerste instantie dient het effect op cytotoxiciteit bepaald te worden. Vervolgens kunnen testen op intracellulaire oxidatieve stress en FD-4 permeabiliteit uitgevoerd worden, en tenslotte kan het gunstige effect van een antioxidant bevestigd worden in de wound healing assay.

Deeldoelstelling 2: Identificeren van de fasen in de zoogperiode alsook in de opfok (vroegspenen, speenleeftijd) van biggen (IUGR versus gemiddeld geboortegewicht) waarbij een verstoorde oxidatieve- en redox status zich voordoet. (analyse dierfactoren) (WP2)

VERGELIJKING IUGR VERSUS NBW IN DE ZOOGPERIODE

IUGR (intra-uterine growth restricted) biggen werden gedefinieerd als biggen met een geboortegewicht tussen 750 en 900 g en behorende tot het laatste kwartiel van de geboortegewichten van de toom. NBW (normal birth weight) biggen zijn biggen met een geboortegewicht tussen het interval gemiddeld geboortegewicht van de toom ± 1 SD. In deze studie werd de ontwikkeling van de barrière functie, intestinale structuur en antioxidant systeem van IUGR en NBW biggen in de zoogperiode vergeleken. Biggen werden bemonsterd op 0, 3, 8 en 19 dagen leeftijd. De epitheliale barrière werd ex vivo gemeten via flux van FD4 en horseradish peroxidase (HRP), histo-morfologische karakteristieken en expressie van tight junction eiwitten. De redox status werd weergegeven via de verhouding glutathione disulfide/glutathione en malondialdehyde concentraties, daarnaast werd de mRNA expressie van een aantal redox gevoelige genen gekwantificeerd. De studie toonde duidelijk aan dat IUGR biggen een sterk verhoogde permeabiliteit vertonen op d0 na geboorte, zowel op 5 en 75% van lengte van dunne darm, en op d3 na geboorte, enkel op 5% van lengte van dunne darm. De mRNA expressie van het tight junction eiwit occludin was verminderd in IUGR biggen op d0, en ook op d19. De oxidatieve- en redoxstatus werden niet of weinig beïnvloed door het type big. Daarentegen was de transcriptie van de genen heme oxygenase 1, catalase en thioredoxin reductase significant verminderd in IUGR biggen, hoofdzakelijk op d0 en 19 na geboorte. Hieruit blijkt dat IUGR een lagere capaciteit hebben om een antioxidant response te tonen in de neonatale periode.

EFFECT VAN KUNSTMATIGE OPFOK OP OXIDATIEVE- EN REDOXSTATUS EN DARMGEZONDHEID

In deze studie werden dezelfde parameters en relaties bestudeerd als in de vorige studie, nl. effecten op oxidatieve-en redoxstatus en darmgezondheid. In deze 2 x 2 factoriële proef werden de factoren type big (IUGR of laaggeboortegewicht biggen, LBW vs. NBW) en opfoksysteem (zogen bij de zeug vs. opfok vanaf 3 d leeftijd op kunstmelk op rescue decks), en hun interactie vergeleken. Op verschillende tijdstippen in de zoogperiode werden biggen bemonsterd. De effecten van het opfoksysteem waren duidelijk veel groter dan type big. Bij kunstmatig opfokken waren er diepere crypten in het proximale gedeelte van de dunne darm. In het distale gedeelte van de dunne darm was dit minder het geval. De poriëngrootte was in de crypten groter en dus werden diepere crypten in verband gebracht met een verhoogde permeabiliteit. De expressie van de tight-junction eiwitten occludine en claudin-3 nam toe naar het einde van de periode van kunstmatige opfok in zowel LBW als in NBW biggen. Deze toename wordt gezien als gunstig voor het herstellen van de barrièrefunctie. Daarnaast bevatten de crypten de stamcellen en verdiepen de crypten wanneer er celdelingen gebeuren. De eiwitexpressie van proliferating cell nuclear antigen (PCNA) bevestigden dit evenwel niet, aangezien lagere PCNA waarden werden waargenomen bij kunstmatig opgefokte biggen. Globaal wordt er een hogere apoptose/mitose ratio gezien in de biggen die kunstmatig opgefokt worden.

EFFECT VAN GEBOORTEGEWICHT, SPEENLEEFTIJD EN VROEGSPENEN OP OXIDATIEVE- EN REDOXSTATUS EN DARMGEZONDHEID NA SPENEN

Het effect van geboortegewicht (IUGR, 0,84±0,09 kg, vs. NBW, 1,37±0,18 kg), speenbehandeling (leeftijd spenen 3w, leeftijd spenen 4w en vroegspenen; vanaf 3d leeftijd kunstmatige opfok op kunstmelk tot 3w leeftijd) op de oxidatieve- en redoxstatus en darmgezondheid na spenen (0, 2, 5, 12 en 28d na spenen) werd onderzocht. De resultaten toonden een duidelijk effect van het tijdstip na spenen aan. In de acute fase na spenen (d0-5) werd villus atrofie en een verstoorde barrière functie (vooral verhoogd op d2 na spenen) van de dunne darm vastgesteld. Het antioxidant systeem werd opgereguleerd. GSH-Px activiteit op 5 en 75% lengte van dunne darm verhoogde met respectievelijk 19 en 50% op d5 na spenen, in vergelijking met d0. Glutathion concentraties stegen in de proximale dunne darm en lever, en piekten op d12 na spenen. In de distale dunne darm nam deze concentratie niet toe na spenen. De redox homeostase (verhouding glutathion disulfide/glutathion) werd niet beïnvloed door spenen. De lipide peroxidatie (malondialdehyde als merker) in plasma, distaal dunne darm mucosa en lever nam af na spenen. Een interactie tussen speenbehandeling en tijdstip na spenen voor de redox homeostase werd wel vastgesteld. De ratio geoxideerd glutathion / gereduceerd glutathion bleef ongewijzigd na spenen bij biggen die conventioneel gespeend werden (speenbehandelingen leeftijd spenen 3w en leeftijd spenen 4w), maar niet bij biggen die vroeggespeend waren. Bij deze biggen nam de ratio toe (meer geoxideerde redoxstatus), gepaard gaanse met een hogere distale dunne darm FD4 permeabiliteit. In deze studie waren er geen significante verschillen tussen IUGR en NBW biggen.

Deeldoelstelling 3: Inschatten van pro-oxidatieve effecten van een experimenteel voeder in vivo en bepalen van aard en dosis van pro-oxidatieve stoffen in vitro (analyse voederfactoren) (WP2 en WP3)

In deze proef was het de bedoeling om na te gaan wat de effecten van een pro-oxidatief voeder zijn, en deze af te wegen tegenover andere factoren zoals het spenen en geboortegewicht. Drie voeders voor gespeende biggen werden aangemaakt: een controle voeder met 5% niet-geoxideerde lijnzaadolie, en twee proefvoeders waarbij respectievelijk 2,5 en 5% van de olie werd vervangen door geoxideerde lijnzaadolie. De geoxideerde lijnzaadolie had een peroxide waarden van 225 mEq O2 / kg olie. Vijf behandelingen werden uitgetest. In de eerste behandelingen werd het controle voeder ad libitum aan gespeende NBW biggen verstrekt gedurende 28 dagen. Daarnaast waren er drie behandelingen waarbij NBW biggen beperkt werden gevoederd (75% van ad libitum) met de drie verschillende voeders. Tenslotte werd een groep IUGR biggen beperkt gevoederd met het proefvoeder met 5% geoxideerde lijnzaadolie. Tussen de behandelingen werden weinig significante verschillen gevonden voor de oxidatieve- en redox status in verschillende weefsels en intestinale functie (oa. barrière). Het effect van spenen was gelijkaardig aan de waarnemingen in de proef hierboven beschreven. Het was duidelijk dat het effect van spenen veel groter was dan het effect van de geoxideerde lijnzaadolie. Wel konden verschillen worden vastgesteld tussen IUGR en NBW biggen na 28d voederen met het voeder met 5% geoxideerde lijnzaadolie. IUGR biggen hadden een hogere malondialdehyde concentratie in het plasma, een lagere ORAC waarde en GSH-Px activiteit in het plasma. Dit wijst opnieuw op de hogere gevoeligheid van IUGR ten aanzien van oxidatieve stressoren.

Deeldoelstelling 4: Bepalen van stoffen en dosis (dosis-respons relatie) met gunstig effect op het antioxidant systeem en redox status van het darmepitheel aan de hand van de ontwikkelde in vitro modellen. (WP3)

Twaalf stoffen met gekende antioxidant eigenschappen werden geselecteerd. In eerste instantie werd voor elke molecule de oxygen radical absorbance capacity (ORAC), met Trolox als referentie, bepaald. Rozemarijnzuur vertoonde de hoogste ORAC waarde (39.6 µmol/mg Trolox equivalenten), gevolg door resveratrol, ferulazuur, curcumin, quercetine, thymol, galluszuur, carvacrol, carnosinezuur, ethoxyquin, naringin en liponzuur. Vervolgens werden deze componenten getest in het in vitro IPEC-J2 celcultuur model beschreven in deeldoelstelling 1. De doelstelling was om potentiële antioxidanten te screenen en te rangschikken in functie van de antioxidant capaciteit, minimale cytotoxiciteit (viabiliteit), het beschermen tegen intracellulaire oxidatieve stress en het ondersteunen/herstellen van de barrièrefunctie. Selenium-methionine werd ook meegenomen in deze testen. In cytotoxiciteitstesten met H2O2-stressed IPEC-J2 cellen kon worden aangetoond dat preincubatie met rozemarijnzuur (optimale concentratie, 400 µM), quercetine (50 µM), galluszuur (780 µM), ethoxyquin (50 µM) en selenium-methionine (250 µM) de cytoxiciteit significant verminderde. Rozemarijnzuur, quercetine, ethoxyquin en selenium-methionine reduceerden ook de intracellulaire oxidatieve stress in de cellen. De verhoogde FD4 permeabiliteit na toevoeging van waterstofperoxide kon significant verlaagd worden door preincubatie met rozemarijnzuur en quercetine. De resultaten tonen dat het in vitro IPEC-J2 celcultuur model een goede tool is om antioxidanten te screenen. Rozemarijnzuur en quercetine kwamen naar voor als meest beloftevolle componenten. In de gebruikersgroep werd overeengekomen om twee in vivo proeven uit te voeren met quercetine.

Deeldoelstelling 5: Ontwikkelen van nieuwe voeder- en managementconcepten voor remediëring van oxidatieve- en redox status bij groepen biggen met verstoorde oxidatieve- en redox status. (WP3)
Deeldoelstelling 6: In vivo remediëring van oxidatieve- en redox status onder gecontroleerde omstandigheden. (WP3)

REMEDIATIE VAN NEONATALE BIGGEN DOOR DRENCHING MET QUERCETINE EN KUNSTMATIG OPGEFOKT

Omdat de grootste uitval gezien wordt bij biggen met een laag geboortegewicht en omdat WP2 bevestigde dat IUGR biggen in de eerste dagen na de geboorte vatbaarder zijn voor een verstoorde redoxstatus, werden in dit experiment aan uitsluitend dieren met een laag geboortegewicht een lage (10 mg / kg lichaamsgewicht) of een hoge dosis (50 mg / kg lichaamsgewicht) quercetine toegediend of werd een controle behandeling ingesteld. De dieren ontvingen een eerste supplement via gavage (oplossing van quercetine in melkvervanger) ten laatste 24 u na de geboorte. Op 3 dagen leeftijd werden ze overgebracht naar de rescue deck, opgefokt met kunstmelk en ontvingen ze dagelijks één dosis van quercetine opgelost in de melkvervanger via gavage (0, 10 en 50 mg / kg lichaamsgewicht). Op tijdstippen 3, 5 en 8 dagen na de geboorte werden dieren geëuthanaseerd en bemonsterd. De toediening van quercetine verliep vlot en zonder nadelige effecten. De groei van de dieren uit de 3 groepen was vergelijkbaar, hoewel de dagelijkse groei bij de dieren in de controlegroep eens op de rescue deck hoger was dan de dieren die werden gesupplementeerd. Verdere analyses zullen aangeven of het toedienen van quercetine bij neonatale IUGR biggen een effect heeft op de oxidatieve- en redoxstatus en darmgezondheid.

REMEDIATIE VAN GESPEENDE BIGGEN GEVOEDERD MET QUERCETINE

In dit experiment werd het effect van quercetine in het pre-starter voeder (d0-14 na spenen) van gespeende biggen op dierprestaties, oxidatieve- en redoxstatus van weefsels en darmbarrière functie en –histomorfologie nagegeaan. Drie dosissen van quercetine (niet-geglycosyleerde verbinding; 100, 300 en 900 mg/kg) werden getest, naast een controle behandeling. Supplementatie van 900 mg per kg voeder resulteerde in een significant hogere voederopname gedurende de starter fase (d14-42 na spenen, +11%). Het lichaamsgewicht op het einde van de proef (d42) vertoonde een tendens om hoger te zijn bij behandeling 900 mg/kg quercetine in vergelijking met controle behandeling (+1.22 kg). Dit is opvallend vermits quercetine enkel werd gesupplemteerd in de eerste 2 weken van de proef. Alhoewel geen significante effecten werden waargenomen, zijn er toch aanwijzingen dat de darmgezondheid van biggen bij behandeling 900 mg/kg quercetine verbeterd was in de acute speenfase (d5 na spenen). Ook was de concentratie aan malondialdehyde in plasma op d5 gereduceerd met 12% ten opzichte van de controle (P=0.015). Verdere analyses zullen deze eerste resultaten moeten bevestigen.

Deeldoelstelling 7: Valideren van kennis en concepten op praktijkbedrijven en maken van technisch-economische evaluatie. (WP4)
Deeldoelstelling 8: Verspreiding en valorisatie van kennis en concepten. (WP4)

De onderzoekspartners hebben actief meegewerkt aan informatievergaring- en verstrekking over de problematiek van ‘overtallige’ en IUGR biggen voor de varkenssector via demodagen (bv. ‘Hoe ALLE biggen in de vleesvarkensstal krijgen?’) en studiedagen (bv. Demoproject ‘Doodgeboren biggen en uitval bij de biggen op het moderne varkensbedrijf’). Twee master thesisstudenten voerden een enquête uit bij de Vlaamse zeugenhouders over de manier hoe ze omgaan met overtallige en IUGR biggen. De resultaten zijn verschenen in vakbladen en werden gepresenteerd op demodagen. Tijdens de slotvergadering van het project werd gepolst naar de impact van het project bij de deelnemende bedrijven in de gebruikersgroep. Door verschillende bedrijven werd aangehaald dat het project heeft geleid tot innovaties in hun producten of nieuw onderzoek binnen het bedrijf initieerde. Ook werd door verschillende deelnemers aangehaald dat met dit project een wetenschappelijke basis werd gelegd, die in de toekomst zal leiden tot verdere innovaties. De gebruikersgroep onderkent het potentieel van antioxidanten om darmgezondheid en dierprestaties te sturen. Disseminatie van de resultaten van het onderzoek werd bekomen door mondelinge presentaties op nationale en internationale symposia en door publicaties in wetenschappelijke tijdschriften en vakbladen, bijdrages in nationale en internationale symposia, en bachelor- en masterthesissen.

BESLUIT

In dit project werd met succes in vitro IPEC-J2 celcultuur model voor screening van antioxidanten geïmplementeerd. Het model toonde duidelijk aan dat oxidatieve stressoren niet enkel de cytoxiciteit en intracellulaire oxidatieve stress verhogen, maar dat deze stressoren ook negatieve effecten hebben op de monolayer integriteit en regeneratievermogen. Met dit model werden 13 moleculen onderzocht, en hieruit bleken quercetine en rozemarijnzuur de beste kandidaten te zijn. In de in vivo proeven kon niet altijd een oorzakelijk verband vastgesteld worden tussen oxidatieve stress en verstoorde redoxstatus enerzijds en karakteristieken van darmgezondheid anderzijds. Wel kon aangetoond worden dat IUGR biggen in de neonatale fase of na langdurige voedering van geoxideerd lijnzaadolie een verminderde endogene antioxidant response vertonen, dat vroegspenen van biggen op 3 dagen leeftijd en opfokken op kunstmelk langdurige effecten kan hebben op darm functionaliteit, bijvoorbeeld op barrière functie, en dat het conventioneel spenen (op 3 of 4 weken leeftijd) een grote impact heeft op het antioxidant systeem, met name werd een upregulatie in de intestinale mucosa vastgesteld. Voorlopige data suggeren dat quercetine potentieel heeft om in vivo (bijvoorbeeld bij conventioneel spenen) de darmgezondheid te verbeteren, met positieve effecten op dierprestaties.

Universiteit Antwerpen, Universiteit Gent
Universiteit Gent
Joris Michiels
Joris Michiels
cc dd (vd), Luc Verhoeven (Just Innovation), Luc Larmuseau (iLLumoo)
Share this on